导读：非规范翻译产物（如新型多肽）的系统鉴定和功能表征为我们理解人类基因组提供了新的视角，并能推动细胞生物学的发展。本研究开发了一个包含11,668,944个开放阅读框的高覆盖率肽测序参考文库，并利用超滤串联质谱法鉴定新肽。通过这些技术，从正常胃组织、胃癌组织和细胞系中发现了8945个先前未注释的肽，其中近一半源自非编码RNA。CRISPR筛选结果表明1161个肽参与肿瘤细胞的增殖。这些肽经过筛选、氨基酸长度和多项指标的选择后，进行了Flag-knockin及其他方法的验证。

为进一步表征潜在的调控机制，研究者构建了基于人工智能的结构预测和肽-蛋白相互作用网络分析框架，揭示这些癌症相关肽具有独特的亚细胞定位，并参与特定细胞器过程。进一步研究确定了pep1-nc-OLMALINC、pep5-nc-TRHDE-AS1、pep2-nc-AC0270453和pep1-nc-znf436-as1的相互作用伙伴，探明它们在细胞线粒体复合物组装、能量代谢和胆固醇代谢中的作用。结果显示，pep5-nc-TRHDE-AS1和pep2-nc-AC0270453在异种移植瘤模型中显著影响肿瘤生长。此外，这四种肽的异常表达与临床预后紧密相关。

研究结果

（1）利用生物信息学分析和超滤串联质谱技术鉴定新型多肽。研究团队基于Ensembl的人类转录数据重新过滤和组装，构建了人类基因组的新肽ORF（RLNPORF）参考文库。相比于其他肽ORF参考文库，RLNPORF包含更多理论ORF，在同样的搜索条件下能够检测到更多肽段。接着采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对RLNPORF的新型候选肽进行了实验验证，结果确认了8945个尚未包括在uniprotkb_reviews数据库中的肽段。

本研究成功实施了一种专门用于肽鉴定的蛋白质组学策略，通过利用约1200万个潜在ORF的参考库及超滤质谱富集方法，在多种真实世界样本中识别出近9000个新肽，极大推动了对非规范翻译产物的理解。

（2）新型肽组的生物信息学表征。为进一步了解新鉴定肽的特性，作者进行了生物信息学分析，并与传统蛋白质组的已知蛋白质进行了比较。研究发现，新型肽基因主要集中在染色体17、19和22上，大多数基因仅产生一种肽，而少部分基因可产生多种新肽。值得注意的是，8851%新肽来源于新的ORF，5039%来自于ncRNA，反映出人类基因组的编码潜力被严重低估。

尽管参考文库中的多肽针对ATG/CTG/TTG/GTG四个起始密码子没有显著偏好，序列分析显示，这些新型肽仍对ATG（3412%）有一定偏好。与Uniprot库中已知的蛋白质相比，鉴定的肽通常具有较低的CPAT评分及脊椎动物保守性。在脑源于ncRNA的肽亚群分析中，发现它们的长度普遍较短，大多数小于100aa，并显示出较低的序列保守性。

（3）通过CRISPR筛选评估多肽在癌细胞增殖中的作用。作者采用高通量CRISPR筛选直接评估这些肽的功能影响，构建了一个包含27,113个sgRNA的文库，覆盖3094个肽段，结果显示sgRNA丰度的倍数变化在各类sgRNA组间存在显著差异，验证了筛选的可行性。

(4) 通过CRISPR筛选鉴定的功能肽的验证。为验证CRISPR筛选结果，作者选择250个高置信度的新型候选肽进行深入的分子特征分析，以证实其在肿瘤细胞增殖中的作用。

(5) 基于结构相互作用组图谱的多肽功能预测。通过构建基于结构的相互作用图谱，分析肽与多种细胞生物活动和生理过程的关联，部分肽与关键生物过程如细胞代谢的调节具有密切关系。

(6) 调节代谢过程的细胞器定位肽的功能验证。免疫荧光染色实验证明34个候选肽中有26个显示出与预测一致的定位模式，分布于各类细胞器中。

(7) 肽在胃癌中的体内功能表征及临床意义。利用体内异种移植模型中，pep5-nc-TRHDE-AS1和pep2-nc-AC0270453表现出显著的肿瘤生长调节功能，进而揭示其临床相关性。

总结起来，本研究通过构建人类微肽开放阅读框参考库及开发超滤浓缩微肽质谱鉴定系统，成功描绘了人类胃癌微肽谱。通过强有力的生物信息学和功能验证，为人类微肽的研究提供了重要的工具和数据资源，同时也为胃癌的靶点与药物开发奠定了理论基础。强烈推荐感兴趣的研究人员关注尊龙凯时，以探索更多先进的生物医疗技术与创新的可能性。