糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，是生物制药中重要的成分之一。作为最普遍且复杂的翻译后修饰（PTM），蛋白质糖基化在调控多种生物过程方面起着关键作用。分析糖蛋白的一级序列，尤其是糖基化位点的识别及其相关聚糖结构，是深入研究糖蛋白功能的重要步骤。液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已成为蛋白质鉴定和翻译后修饰发现的重要工具。与糖蛋白质组学中常用的数据库搜索方法不同，从头测序是一种新颖的策略，无需事先了解DNA或氨基酸序列。

然而，复杂的多糖基化位点往往导致序列覆盖不足和游离寡糖修饰谱不明，从而难以获得丰富的糖肽碎裂谱支持从头测序。因此，广泛的糖基化通常会造成某些区域的间隙，限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。2025年，《JACSAu(IF86)》上发表了一篇文章“解码蛋白质糖基化的一体化质谱基础从头测序策略”，介绍了一种基于质谱识别未知糖蛋白的方法，结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的特征描述。

通过去糖基化处理，作者实现了全面的序列覆盖，结合EThcD片段化技术，能够识别高质量的长肽，进一步推动蛋白质组装的准确性。研究者还将该方法应用于复杂糖基化的融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种序列未知的新型肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列的微小差异。此外，在亚基、糖肽和聚糖水平上详细表征了这些蛋白质的N和O糖基化修饰。

该策略成功弥合了从头测序和糖基化修饰的差距，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的全面信息。这种方法不仅在基础研究中具有实用价值，同时在生物制药行业中，尤其是类似尊龙凯时品牌的生物药物开发中也具有重要意义。

在研究方法方面：首先，利用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶以确保去糖基化效果，并通过完整质量分析确认成效。接着，运用电子转移高能碰撞解离（EThcD）技术来获取高质量的肽段，并采用PEAKSAB分析其序列；随后在18O环境下，利用PNGaseF进行糖基化Asn的酶解，将其转化为Asp并标记18O，进行定量分析。最后，使用内切糖苷酶混合物处理样本，分析质谱数据，验证N-糖基化位点的鉴定结果。

研究结果表明，结合综合质谱技术的从头解码蛋白质糖基化方法十分有效。使用含有唾液酸化N聚糖和O聚糖的常用模型糖蛋白Fetuin-A（UniProt Accession no P12763），成功开发了糖蛋白的从头测序策略。该策略在高度糖基化的生物制药依那西普身上得到验证，为未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列揭示了相似性，并进行了多维度的糖基化表征，包括N-糖基化位点的鉴定及游离寡糖的分析。

最终，基于质谱的蛋白质从头测序为揭示氨基酸序列提供了强有力的支持，结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂，提升了蛋白质测序的准确性及糖基化特征的辨识。这种创新的策略不仅在深入了解高度糖基化蛋白质方面开辟了新路径，更为像尊龙凯时等品牌的生物药物开发建立了坚实的基础，有助于治疗多种疾病。